【干貨分享】Western實驗步驟及產(chǎn)品選擇

Western blot，也稱Western blotting、Western印跡，常簡寫為WB，是用抗體檢測蛋白表達(dá)的重要方法之一。WB步驟操作如下：

一、 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

1、裂解液的選擇

根據(jù)蛋白在細(xì)胞中的位置選擇合適的裂解液，例如RIPA強(qiáng)(R1091)用于核蛋白及膜蛋白的提取、RIPA中（R1090）用于胞漿蛋白的提取、而RIPA弱或者western專用裂解液（W0013）適用于較好提取的蛋白；

對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提

2、抑制蛋白降解

為防止蛋白的降解，需要添加蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等。例如LABLEAD的蛋白酶抑制劑cocktail（C0101）是一種廣譜型的抑制劑，由六種成分配置成的溶液，可適用于蛋白純化，western，IP等各種實驗。

如研究磷酸化蛋白，為保持蛋白的穩(wěn)定，可使用磷酸蛋白酶酶抑制劑（C0104）。

3、蛋白定量：

收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。

如果使用LABLEAD的裂解液(R1091、R1090、W0013)，可使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(B5001)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(B5106)。

如自己配置裂解液，其中含有triton x-100、SDS等去污劑時，推薦使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(B5001)；如溶液中含有EDTA、DTT等還原劑時推薦使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒（B5105）

二、電泳(Electrophoresis)

1、SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠分幾種配置的方式，如需自行配置可購買制膠液，如30%制膠液（A3291）、4*SDS濃縮膠緩沖液（S4880）、4*SDS分離膠緩沖液（S4680），也可使用LABLEAD生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P1050M)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0105)。兩種試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。

如需更方便的電泳，可使用LABLEAD的各種濃度規(guī)格的預(yù)制膠產(chǎn)品(P00812/P00815/P01012/P01015/P01212/P01215/P41212/P41215/P42012/P42015)。

2、樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如4X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，推薦LABLEAD的蛋白上樣緩沖液(4X)(G2526)或 蛋白上樣緩沖液(5X) (G2527)。

如果是非變性樣品，可以使用非變性非還原性蛋白上樣緩沖液(G2621)。

樣品處理時可按照100℃或沸水浴加熱3-5min，或者95℃ 加熱10min，以充分變性蛋白。如使用預(yù)制膠，可適當(dāng)延長樣品處理的時間。

3、上樣與電泳

蛋白樣品冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。

LABLEAD提供各種預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)用于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。最好使用彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P1017/P1018/P1025/P10310)。

電泳液推薦使用蘭博利德生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液(T7777)，或者可以長期儲存的速溶顆粒產(chǎn)品（T7206M）。

電泳時推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。為了方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時時間為90-120分鐘。設(shè)置定時可避免發(fā)生電泳過頭的情況。

當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或可根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

三、 轉(zhuǎn)膜(Transfer)

推薦在Western實驗中選用PVDF膜，優(yōu)先推薦使用PVDF膜，如蛋白分子量大于20KD推薦使用(進(jìn)口分裝，13.25*15cm,0.45μm) (IPVH00010-1)，蛋白分子量小于20KD推薦使用(進(jìn)口分裝，13.25*15cm,0.45μm) (ISEQ00010-1)。PVDF膜在使用前須經(jīng)甲醇浸潤和活化。也可使用硝酸纖維素膜(NC膜)，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。

轉(zhuǎn)膜推薦使用bio-rad的預(yù)裁轉(zhuǎn)印濾紙(7.5×10cm) (cat：1703932)，吸水性強(qiáng)，不掉屑。

轉(zhuǎn)膜溶液推薦使用LABLEAD的10X轉(zhuǎn)膜緩沖液(T3011)，需要在稀釋是添加20%的甲醇，以提高轉(zhuǎn)膜效率。出于安全性、省事性的考慮LABLEAD還有使用乙醇配置的轉(zhuǎn)膜緩沖液，20x快速轉(zhuǎn)膜緩沖液（T3012）

通常濕式轉(zhuǎn)膜方式，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。

如使用伯樂的Turbo系統(tǒng)進(jìn)行半干轉(zhuǎn)時，在使用伯樂配套的轉(zhuǎn)膜緩沖液（）時，則可參考以下轉(zhuǎn)膜條件：2.5A恒流，限壓25V，3-5min即可完成轉(zhuǎn)膜。

在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

轉(zhuǎn)膜的效果可參考所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，其中分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色，用于觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可用免脫色考馬斯亮藍(lán)快速染色液(G1042)對完成轉(zhuǎn)膜的蛋白膠進(jìn)行染色，用于檢測轉(zhuǎn)膜的效果。

四、封閉(Blocking)

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將蛋白膜放置到預(yù)先加入了清水的孵育盒（FYH01-1）中，漂洗1-2分鐘，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后的所有步驟，要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則很容易產(chǎn)生較高的背景。

倒掉洗膜后的液體，推薦加入適量的快速封閉液(P0203)，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉20-30分鐘；也可以加入用脫脂奶粉（N7861）配置的5%的溶液作為封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60分鐘或者4度過夜。對于一些背景較高的抗體，兩種封閉液都可以適當(dāng)延長封閉時間，如有必要甚至可以4℃封閉過夜。

五、一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用一抗稀釋液(D0151)稀釋一抗。一抗也可以用TBST溶液或者配置好的封閉液稀釋，但是為了延長一抗的使用時間，推薦用一抗稀釋液。

收集封閉液，然后加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜。也可根據(jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r間。

回收一抗。加入TBST緩沖液(T9039)洗去未結(jié)合的一抗，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對照，可以選用Tubulin抗體(T0100)、Actin抗體(A0101)或GAPDH抗體(G0100)，進(jìn)行內(nèi)參檢測。

六、二抗孵育(Secondary antibody incubation)

參考二抗的說明書選擇辣根過氧化物酶(HRP)等標(biāo)記的二抗。二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如山羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(S0100)。

加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。

回收二抗，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘，重復(fù)洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

七、顯影檢測

使用LABLEAD ECL發(fā)光液來檢測蛋白，ECL發(fā)光液 普通款（E1050）一般使用暗室曝光時可推薦此款。如需更靈敏的發(fā)光液，推薦使用 ECL 超敏發(fā)光液（E1060），和 ECL 超敏發(fā)光液M（E1070，和millipore WBKLS0100同級別）；如蛋白豐度極低時推薦使用 ECL超敏發(fā)光液(femto)（E1080）。

八、膜的重復(fù)利用

如果蛋白樣品很寶貴，可使用膜再生液(M0500)處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。再次重生使用的膜需要重新封閉后孵育新的二抗。